肌（jī）萎縮性脊髓側索（suǒ）硬化症

因中（zhōng）樞神經係統內控（kòng）製骨（gǔ）骼肌運動的神經元退化導致的肌萎縮性脊（jǐ）髓側索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis： ALS，也稱漸凍人症）是一種（zhǒng）漸進且致命的神經退行性疾病。由於運動神經（jīng）元（yuán）退化和死亡，肌肉逐漸萎縮致大腦完全喪失（shī）控製隨意運動的能力，最終會造成（chéng）發音、吞咽，以及呼吸和運動（dòng）障礙。著名物理（lǐ）學家霍金（jīn）就是（shì）一（yī）名ALS患者。目前還沒有真正可有效治療ALS的藥物和方法。

絕大多數（90-95%）的ALS發病原因不明，但也（yě）有（yǒu）約5-10%的ALS患者表現出了家族遺傳性，其中超氧化物歧化（huà）酶 1（Superoxide Dismutase 1：SOD1）基因突變約占這些遺傳性ALS病例的（de）10%。SOD1也是第一個被鑒定出（chū）來的ALS風險基因[1]，因此很快就有科學（xué）家構建了一種含有第93位甘氨酸突變為丙氨酸（suān）（G93A）的人SOD1基因的轉基因小鼠模型（xíng），全名為B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J轉基（jī）因小鼠[2]。該轉基因小鼠（shǔ）基因組中被轉入了23個拷貝的人源SOD1*G93A突變基因，接下來我們將其簡稱SOD1*G93A轉基因小鼠。

圖二：SOD1*G93A轉基（jī）因小鼠是以B6和SJL雜交子代為背景品係，通（tōng）過原核注射和胚胎移植得到（dào）的轉基因小鼠模型，因此其毛（máo）色多樣，圖片來自Jax實驗（yàn）室（https://www.jax.org/strain/002726）

自1996年SOD1*G93A轉基因小鼠問（wèn）世以後，其就（jiù）被廣泛應用於ALS藥物研發的臨床前動物試驗中。到2004年，短短8年時（shí）間內，已至少有50篇文章描述了從小分子（zǐ）到病毒載體的各類ALS治療方案，可延長SOD1*G93A轉基因小鼠的壽命，其中最長（zhǎng）可（kě）以延長壽命100天（78%的壽命延長）。這些藥物很快進入臨（lín）床試驗，然（rán）而，迄（qì）今為（wéi）止（zhǐ），除（chú）了利魯唑（zuò）（最多延長ALS患者兩個月壽命）之外，沒有任何一種藥（yào）物顯（xiǎn）示出對人類ALS疾病的進程有顯著影響[3]。這給醫藥公司帶來了巨大損失，如2008年在美國國家科學院院刊上發（fā）表的一篇文章（zhāng）顯示鋰可（kě）以（yǐ）將SOD1*G93A轉基因小鼠的存活時間延長30天[4]。由於鋰早已經被用於治療精神分裂症（zhèng），許多ALS患者開始超說明書服（fú）用該藥物，希望減緩疾病進（jìn）程。然而，招募了數百名（míng）患者，花費（fèi）了遠超1億美元（yuán）的三個同時啟動的獨立III期臨（lín）床試驗結果卻顯示鋰對ALS無任何治療效果。

其實（shí）不（bú）僅僅是ALS的藥（yào）物研發，在整個醫藥研發領域，動物實驗結果的平均臨（lín）床轉化率也是非常低的，平均在11%左右  。那麽（me）到底（dǐ）是（shì）什麽原因導致了（le）如此高比例的（de）動物實驗（yàn）結果無法實現在人類的臨床轉化呢？

1999年，美國麻（má）省理工學院的（de）機械工程師詹姆斯·海伍德在得知（zhī）他的哥（gē）哥（gē）史蒂芬·海伍德被確（què）診患有ALS，並無任何有效治（zhì）療方法後，與家人一起創立（lì）了一家非（fēi）盈利性生物技術公司，即ALS 治療開發（fā）研究（jiū）所 (ALS-TDI)。ALS-TDI成立後開展了（le）一項旨在尋找SOD1*G93A轉基因小鼠實驗結果臨床轉化失敗原因（yīn）的項目（mù），即使（shǐ）用SOD1*G93A轉基因小鼠重複已發表科研論文中的動物實驗，以找出其臨（lín）床轉化失敗的（de）原因。

在ALS-TDI開展的重複性實驗中，他們不僅嚴格執行盲法對照，而且對給藥組和對照組的動物進行（háng）了更為精細的分配和動物篩查以排除係統誤差。他（tā）們分組及實驗要求包括：

⑴ 年齡匹配（pèi）；

⑵ 性別匹配；

⑶ 同窩匹配：即使用同一天出（chū）生的同一非轉基因母親和轉基（jī）因父親的後代進行分組，具體來說，治療組中的每個雄性（和雌性）在對照組中都有一個同窩兄弟（和姐妹）；

⑷ 樣本量設定（dìng）：每組使用動物數量為（wéi）24隻（12雌，12雄）；

⑸ 死因（yīn）篩查（chá）：檢查記錄每（měi）一（yī）隻動物的死亡（wáng）原因，排出非ALS致死個體；

⑹ 轉基因拷貝數監控：有（yǒu）研究證明SOD1*G93A轉基因小鼠在傳代過程中會出現轉基因拷貝數丟失的現象，且低拷貝的轉基（jī）因小鼠的平均（jun1）壽命會加長。

在這一嚴格實驗分組和動物篩查條件下，ALS-TDI的科研人員總共使用了5429隻（zhī）SOD1*G93A轉基因小鼠測試了包括（kuò）利魯唑在內的100多種（zhǒng）（大部分已有論（lùn）文發表並證明可（kě）延長SOD1*G93A轉基因小鼠壽命）候選化合物，卻沒有發現任一化合物表現出可延長SOD1*G93A轉基因小鼠（shǔ）壽命（mìng）的效果（圖三）。

圖三：ALS-TDI以SOD1*G93A轉基因小鼠開展的重複實驗結果與已（yǐ）發表實驗結果對比[3]

為找出導致那些已經發表實驗結果無法（fǎ）被（bèi）重複的原因，他（tā）們以在ALS-TDI開展實驗中所使用的2000多隻對照小鼠作為研究對象，進行了（le）計算機分組模擬實驗。由（yóu）於（yú）這些小鼠從出生到死亡及死亡原因的信息在ALS-TDI都有詳細的記錄，因此他們能夠以所（suǒ）有對照小鼠為數據庫，分析（xī）前述重複實驗中設定的（de）不同（tóng）分組和動物篩查條件對實驗結果（guǒ）的影響。即通過計算機對這些沒有經過任何藥物處理的小鼠進行分組，將一組設為假定的實（shí）驗（yàn）組，而另一組設為假定（dìng）的對照（zhào）組，然後依據（jù）已有的（de）小鼠死亡（wáng）時間記錄，統計兩（liǎng）組（zǔ）小鼠之間是否存在顯著差異。經過（guò）多次重複，計算（suàn）出現5%以上顯著差（chà）異的百分比。由於這些對照小鼠沒有接受過任何化合物（wù）處理，因此如果假（jiǎ）定的實驗組和對照組中出現了顯著（zhe）性差（chà）異，那麽其（qí）來源應該是分（fèn）組時的係統（tǒng）誤差。

結果顯示，在樣本量大小（xiǎo）為4的計算機分組模擬對比實驗中，在隨機分組（zǔ）和不進行死因篩查（chá）及排除（chú）低轉基因拷貝數個體條件（jiàn）下（xià），兩組間出現顯著差異的可能性（xìng）超過了50%。而隨機（jī）分（fèn）組（zǔ）的同時（shí）進行（háng）死因（yīn）篩查並排除低轉基因拷貝（bèi）數個體和進行性別匹配的分組條件（jiàn）下，樣本量為4的模擬分組實驗中也有30%的可能出現兩組死亡時間的顯著差異（圖四）。隨著樣本量（liàng）的增加（jiā），出現顯著性差異的可（kě）能（néng）性逐漸減少，但要實現低於5%（統計學上通常設置的顯著置信區間）的顯著性差異，樣本量要達（dá）到每組24隻動物。如（rú）果不做分組（zǔ）條件控製，即使樣本量到50隻也難以排除係統誤差。

圖四：分組條件導致的係統誤差[3]

ALS- TDI的這個計算機模擬實驗結果說明，前述那些已經發表的基於SOD1*G93A轉基因小鼠實驗結果無法實現臨床轉化的真正原因極大可能（néng）源於其實驗設計的不合理。這（zhè）些實驗因為沒有排除分組時的係統誤差而導致了假陽（yáng）性結果。這個研究也（yě）暴露了當下（xià）使用實驗動（dòng）物開展研究（jiū）的諸多問題，如盲目地追求減少使用動物的數量；對所用動物遺傳、微生物和繁殖（zhí）等特性不了解；實驗過程中對（duì）動物關注不夠，不清楚動物（wù）發病或死亡的（de）真正原因等。這些問題不僅僅需要引起實驗動物從業人員的注（zhù）意（yì），科研人員同（tóng）樣（yàng）需要給予（yǔ）關注。因為實驗設計（jì）不嚴謹導致的（de）假陽性結果（guǒ）不僅是人力（lì）、物力和財力的巨大浪費（fèi），也嚴重有違動（dòng）物實驗倫理福利，這樣的實驗不會帶來科學進步，且浪費了大量實驗（yàn）動物的生命（mìng）。比如在ALS-TDI開展的無法重複（fù）出已發表結果的實驗中（zhōng），那些已經發表的工作累計使用小鼠的數量就超（chāo）過（guò）了18000隻。此外，在動物實驗倫理申請時常用替代、優化和減少（俗稱3R原則（zé））原則來指導倫理審查工作，有（yǒu）時為了滿足（zú）3R原則中的（de）“減少”原則，加上開展實驗成本的（de）考（kǎo）慮，往往選擇使用（yòng）最少的動物數量（比如多為每組6隻），但從ALS-TDI的這個研（yán）究看，樣本量過小，會導致係統誤差加大，因此極大可（kě）能（néng）出（chū）現假陽性結果。這個時候（hòu）大家或許忘了3R原則使用的大（dà）前提是要能夠實現擬開展實驗的科學目標（biāo），如果單（dān）純為了“減少”而使用更少的實驗動物（wù）導致科學目標無法實（shí）現，那（nà）不是減少（shǎo），而是對（duì）動物生命的漠視。

參考文獻（xiàn）：

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